DNR sekoskaitos centras

Įvadas

DNR sekoskaitos centre (SC) tiriamosios DNR seka nustatoma automatiniu 16 kapiliarų genetiniu analizatoriumi 3130xl (Applied Biosystems), kuriuo atliekama fluorescentiniais dažais žymėtų DNR fragmentų elektroforezė, jų detekcija lazeriu ir kompiuterinė analizė.

DNR sekoskaitos reakcijos ruošiamos naudojant sekoskaitos rinkinį BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ir remiasi DNR grandinės terminacijos (Sanger-dideoxy) metodu su fluorescentiškai žymėtais terminatoriais (ddNTP). Su šiuo rinkiniu gali būti tiriama viengrandė DNR, plazmidinė DNR,  PGR produktai, kosmidės.

Daugiau  informacijos apie rinkinį galima rasti dokumente BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Protocol (www.appliedbiosystems.com )

Mėginių pateikimas

Mėginiai SC turi būti pateikiami laikantis MĖGINIŲ DNR SEKOSKAITAI PATEIKIMO INSTRUKCIJOJE nurodytų reikalavimų. Instrukciją ir užsakymo DNR sekoskaitai formas rasite čia.

DNR gryninimas

DNR švarumas – vienas svarbiausių faktorių, lemiančių DNR sekos nustatymo sėkmę. Kai kurie

rekomenduojami DNR gryninimo metodai pateikiami Applied Biosystems Inc. dokumento Automated DNA Sequencing Chemistry Guide P/N 4305080 ( www.appliedbiosystems.com )

šiuose skyriuose:

• viengrandė DNR -  3 skyrius, Performing DNA Sequencing reactions, nuo 3-2 iki 3-6 psl.
• plazmidinė DNR -  3 skyrius, Performing DNA Sequencing reactions, nuo 3-6 iki 3-8 psl.
• PGR produktai-  3 skyrius, Performing DNA Sequencing reactions, nuo 3-10 iki 3-14 psl.

Taip pat Qiagen Inc. dokumento Qiagen Guide to Template Purification and DNA Sequencing ( www.qiagen.com ) 7 skyriuje, DNA Template Purification.

DNR gryninimui taip pat gali būti naudojami ir šie rinkiniai:

• plazmidinei DNR –

GeneJET Plasmid Miniprep Kit, THERMOSCIENTIFIC (www.thermoscientific.com);

NucleoSpin Plasmid, MACHEREY-NAGEL (www.macherey-nagel.com);

Perfectprep Mini Plasmid Isolation Kit, EPPENDORF (www.eppendorf.com);

FastPlasmid Mini Kit, EPPENDORF (www.eppendorf.com).

• PGR produktams –

GeneJET PCR Purification Kit, THERMOSCIENTIFIC (www.thermoscientific.com);

GeneJET Gel Extraction Kit, THERMOSCIENTIFIC (www.thermoscientific.com);

Perfectprep Gel Cleanup Kit, EPPENDORF (www.eppendorf.com);

Cyclo-Pure, Gel Extraction Kit, AMRESCO (www.amresco-inc.com).

DNR gryninimo metodai tik tuomet suteikia patikimus rezultatus, jei tiksliai laikomasi metodo aprašyme esančių nurodymų.

Priemaišos

Neigiamų DNR sekoskaitos rezultatų priežastimi gali būti šios priemaišos:

• baltymai
• RNR
• chromosominė DNR
• nespecifiniai PGR produktai
• PGR reakcijos komponentai (pradmenys, dNTP, fermentai ir kt.)
• organinės medžiagos (fenolis, chloroformas, etanolis)
• detergentai
• druskos

Plačiau apie priemaišų poveikį sekoskaitos rezultatams ir kitus DNR sekos nustatymo trukdžius  Applied Biosystems Inc. dokumento Automated DNA Sequencing Chemistry Guide 7 skyriuje, Data Evaluation & Troubleshooting, nuo 7-10 iki 7-12 psl., nuo 7-16 iki 7-29 psl.

DNR koncentracijos ir kokybės nustatymas

Tiksliai nustatyta DNR koncentracija ir DNR kokybė yra labai svarbūs ruošiant sekoskaitos    reakcijas. Kiekybiškai ir kokybiškai DNR gali būti įvertinama šiais metodais:

• Elektroforezė agarozės gelyje

Šiuo būdu nustatomi esantys nespecifiniai PGR produktai, RNR. Esant nespecifinių PGR produktų, turi būti naudojamas vienas iš anksčiau nurodytų DNR gryninimo iš agarozės gelio metodų.

• Spektrofotometrinis

Santykis A₂₆₀/A₂₈₀ turi būti 1,7 – 1,9. Mažesnis santykis rodo, kad DNR mėginyje yra baltymų arba organinių medžiagų, didesnis – esama RNR.

Pradmenys

Keletas rekomendacijų pasirenkant DNR sekoskaitos pradmenį:

• Pradmenį turi sudaryti nemažiau kaip 18 nukleotidų – tai garantuoja gerą hibridizaciją  (tinkamiausias 18 – 25 nukleotidų).
• Vengti vienodų nukleotidų sekos pasikartojimo, ypač 4 ar daugiau G – tai svarbu 3‘ gale.
• Išlaikyti pradmenyje G-C nukleotidų kiekį 50-55 %.
• Ciklinės DNR sekoskaitos rezultatai geresni, kai T_m > 50 °C (tinkamiausia T_m 55 - 65 °C) [T_m = (A + T) × 2 °C + (G + C) × 4 °C].
• Pradmenų, turinčių mažiau nei 50% G-C nukleotidų, seka turėtų būti pailginama virš 18 nukleotidų, kad išlaikyti T_m>50 °C.
• Būtina vienintelė hibridizacijos vieta ir pradmens sekos 100% komplementarumas su DNR seka.
• Gali būti naudojamos pradmenų parinkimo kompiuterinės programos ( pvz. Primer 3 ir kt.).
• Vengti pradmenų, galinčių sudaryti antrinę struktūrą ir  pradmenų dimerus.

Daugiau informacijos apie pradmenis pateikiama Applied Biosystems Inc. dokumento Automated DNA Sequencing Chemistry Guide 3 skyriuje, Performing DNA Sequencing reactions,nuo 3-18 iki 3-19 psl.

Rezultatai

DNR sekoskaitos rezultatai užsakovui gali būti pateikiami el. paštu kaip tekstinis dokumentas (.seq),  elektroferogramos  pateikiamos  ABI formatu (.ab1).

ABI formato dokumentus galima peržiūrėti, naudojant įvairias programas, pvz. Vector NTI, Chromas ( nemokamą Chromas Lite versiją rasite  www.technelysium.com.au/chromas.html ) ir kt.

Nuorodos

Daugiau išsamesnės informacijos apie DNR sekoskaitos svarbiausius dalykus – automatinės fluorescentinės sekoskaitos principus, DNR paruošimą ir gryninimą, sekoskaitos rezultatų (elektroferogamų) interpretavimą, DNR sekos nustatymo problemas ir jų  sprendimo būdus ir kt. – galima rasti tinklapyje http://www.roswellpark.edu/shared-resources/biomolecular-resource-facilities/dna-sequencing

Paslaugų kainos

Informacija anglų kalba: DNA Sequencing Center.

Kontaktinė informacija:

Eglė Rudokienė

chemikė-tyrėja

El. p.: 

Telefonas: 85 2234370

Adresas: V417, Saulėtekio al. 7, LT-10257 Vilnius